制作激光共聚焦顯微鏡的樣品是一個(gè)涉及多個(gè)步驟的過(guò)程，以下是一個(gè)清晰的制作流程，結(jié)合了參考文章中的相關(guān)信息：

1. 組織采集與固定

采集：根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和目的采集不同來(lái)源的組織。

固定：

液氮冷凍法：新鮮組織采集后，直接放入液氮中保存。

多聚甲醛(PFA)固定法：適用于小鼠、大鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織。將組織塊置于4% PFA中進(jìn)行后固定，固定的時(shí)間可根據(jù)組織塊的大小和致密程度調(diào)整，如4℃固定過(guò)夜或室溫1～4 h。

2. 組織保存與預(yù)處理

洗滌：用0.01 mol/L PBS緩沖液洗3次，每次10～30 min。

脫水：在20%蔗糖中4℃浸泡1 h以上，待組織塊下沉后，即可進(jìn)行后續(xù)步驟。

保存：組織塊可置于4℃冰箱保存于20%蔗糖(含0.05% NaN?)中，一個(gè)月內(nèi)完成切片。

3. 冷凍包埋與切片

冷凍：

氣體CO?冷凍包埋法：將組織塊放在濾紙上吸取表面液體，放入樣品臺(tái)的冷凍包埋劑(OCT)中，用CO?氣體迅速冷凍組織樣品。

液氮冷凍法：將組織塊置于樣品臺(tái)的OCT中，先在液氮中迅速浸提幾次，直至樣品溫度與液氮溫度平衡，之后移至冷凍切片機(jī)中。

切片：使用冷凍切片機(jī)，將組織切成5～15 μm的切片，粘貼于處理過(guò)的載玻片上。

4. 免疫熒光抗體標(biāo)記

切片處理：將冷凍組織切片從-80℃冰箱中取出，室溫放置10min，待切片回溫并干燥，浸于PBS中10min洗去OCT。

標(biāo)記：無(wú)需Triton處理，即可進(jìn)行免疫熒光抗體標(biāo)記，操作步驟與培養(yǎng)細(xì)胞反應(yīng)方法相同。

5. 封片與保存

封片：使用抗熒光淬滅的封片劑封片，以減少熒光信號(hào)丟失。

保存：4℃保存，等待觀察。

注意事項(xiàng)

樣品承載物：如觀察貼壁細(xì)胞或組織切片，可用普通載玻片和蓋玻片；如觀察懸浮細(xì)胞或懸浮粒子，可用共聚焦顯微鏡專用的培養(yǎng)皿。

染料選擇：根據(jù)共聚焦顯微鏡配備的激光器波長(zhǎng)選擇熒光染料，避免不同熒光染料的發(fā)射波長(zhǎng)重疊。

通過(guò)遵循以上步驟和注意事項(xiàng)，可以制作出適用于激光共聚焦顯微鏡的高質(zhì)量樣品。