激光共聚焦顯微鏡對樣品的要求相對嚴格,以確保測試結果的準確性和可靠性。以下是對樣品要求的具體介紹:
一、生物樣品
熒光表達檢查:S先,在熒光顯微鏡下觀察熒光表達是否正常,以確定是否有必要使用激光共聚焦顯微鏡。
蓋玻片厚度:蓋玻片的厚度應小于或等于0.17mm,以確保測試過程中的光學性能。
激發波長和發射波長:需要明確樣品的激發波長和發射波長,以便在測試過程中進行正確的設置。
掃描參數:對于需要重構的樣品,需要明確掃描區域的大小、位置和Z步進等參數,這些參數會直接影響測試時間。
樣品固定:樣品B須貼壁良好,不能懸浮,需要在載玻片上固定好后進行送樣測試。同時,樣品需要加抗熒光淬滅劑以防止熒光信號在測試過程中減弱或消失。
細胞樣品:對于細胞樣品,如貼壁細胞或懸浮細胞,在染色結束后需使用抗熒光淬滅劑或50%甘油(甘油和PBS 1:1)進行封片。此外,對于貼壁不牢的細胞或需要特殊處理的細胞,可能還需要使用特定的包被劑如poly-L-Lysine、Fibronectin、Laminin等,或使用玻璃底的共聚焦專用培養皿進行檢測。
組織樣品:組織樣品無論是石蠟切片還是冰凍切片,都需要單層且能很好地貼附在樣品池中。冰凍切片的厚度一般在8-10μm之間,而石蠟切片的厚度則在4-5μm之間,這樣的厚度可以獲得較好的成像效果。此外,用于免疫熒光抗體標記組織切片的載玻片還需經過明膠、蛋白膠、多聚賴氨酸、硅烷等處理,以粘貼組織切片并防止其在免疫反應過程中脫落。
二、材料樣品
樣品制備:主要測試偏材料的樣品,需要提前制備好并確保樣品平整。
樣品尺寸:樣品的尺寸沒有具體要求,但拍出來的Z大面積應在一定范圍內(如1.11x1.8mm到5x5mm),顏色也可根據需要進行調整。
三、其他注意事項
樣品標記:樣品需經熒光探劑標記(可單標、雙標、三標),以便在測試過程中進行識別和定位。
固定劑和封片劑:針對不同抗原結構特點選用合適的固定劑,如有機溶劑固定劑(丙酮、甲醇)和交聯劑固定劑(多聚甲醛)。封片劑可防止樣品熒光褪色、干燥及蓋玻片脫落,如臨時封片可封于甘油+PBS(1:1)中,Y久封片可采用Mowiol等封固劑。
儀器使用和管理:在使用激光共聚焦顯微鏡時,應記錄關機時間、儀器狀況等信息,并嚴格按照操作規程進行操作。
綜上所述,激光共聚焦顯微鏡對樣品的要求涉及多個方面,包括樣品的熒光表達、蓋玻片厚度、激發波長和發射波長、掃描參數、樣品固定、細胞和組織樣品的特殊處理以及樣品標記和固定劑等。這些要求共同確保了測試結果的準確性和可靠性。